lncrna引物设计系统敲除整个外显子或lncRNA的效率如何

来源：互联网　2023-06-30 09:22:12

提起lncrna引物设计（CRISPR/Cas9敲除LncRNA或者外显子的效率是多少？）大家在熟悉不过了，被越来越多的人所熟知，那你知道lncrna引物设计（CRISPR/Cas9敲除LncRNA或者外显子的效率是多少？）吗？快和小编一起去了解一下吧！

lncrna引物设计(CRISPR/Cas9)敲除LncRNA或外显子的效率如何？)

经常有朋友问用CRISPR/Cas9系统敲除整个外显子或lncRNA的效率如何，与敲除片段的大小有关吗？为了回答这个问题，我想和大家分享一篇文章，验证这种敲除的效率。

【资料图】

题为“哺乳动物细胞中簇状规则间隔回文重复序列(crispr)/cas9核系统介导的基因组删除效率的表征”的文章于2014年在JBC发表。NCBI显示它被引用了154次。

为了研究CRISPR/Cas9介导的基因组片段敲除的效率，本文设计了一系列配对的sgRNA，用于敲除长度为1.3kb至1MB的片段(图1)。这些片段有的位于外显子区，有的位于内含子区，有的位于基因间区。而且编辑过的基因与细胞增殖无关。

图一。配对sgRNA的靶设计

配对的sgRNA设计，虽然有可能敲除sgRNA的两个中间片段，但也有可能原位修复而不缺失。为了检测特异性结果，在不同靶附近设计了几对引物。

图二。用于分析修复结果的引物设计

在开始检测细胞是否有等位基因敲除时，使用图2中的上述两对蓝色和红色引物，红色引物位于两个SGRNAs之间，蓝色引物位于两个SGRNAs之外。这个时候，有三种情况。之一，如果红色引物PCR后DNA凝胶没有条带，蓝色引物PCR有条带(如果中间片段没有敲除，蓝色引物中间片段太长，PCR不能扩增产物)，说明纯合敲除。其次，如果红色引物PCR有条带，蓝色引物PCR也有条带，说明杂合子敲除。再次，如果红色引物PCR有条带，而蓝色引物PCR没有条带，说明没有敲除。

但是对于红色引物PCR产物的条带，还有一种情况需要分析，就是sgRNA的两个中间片段是否是反向的。因此，作者设计了图2中的两对绿色和紫色引物来扩增sgRNA靶及其相邻序列。如果引物1和2以及引物3和4有条带，则意味着没有倒位。如果引物1和3以及引物2和4有条带，这意味着中间片段是反向的。

图3。成对sgRNA切除基因片段的效率

从7对sgRNA中筛选出1974个克隆，最终检测出278个单克隆细胞系。根据等位基因分析，278个细胞有556个等位基因。49/556 (26.8%)等位基因中间片段缺失，72/556(12.9%)等位基因中间片段倒位，其余60%在Cas9的切割位置原位修复，未导致缺失。当外显子敲除完成时，等位基因倒位也可以被认为是基因编辑的一种方式。总体来看，等位基因倒位加缺失的比例接近40%。但对于lncRNA的敲除，不建议使用倒置克隆进行后续实验，因为不确定倒置是否会使其功能失活。

根据细胞系分析，31/278(11.2%)细胞为双等位基因缺失细胞，2/278(0.7%)细胞为双等位基因倒置细胞。在26/278(9.4%)的细胞中，一个等位基因缺失，另一个等位基因逆转。在61/278(21.9%)的细胞中，一个等位基因被敲除，另一个等位基因在Cas9的切割位置被原位修复。在39/278(14.1%)的细胞中，一个等位基因被倒位，另一个等位基因在Cas9的切割位置被原位修复，而两个等位基因未被缺失或倒位的细胞比例为119/278(42.8%)(图3)。

整合所有数据后，文章进一步分析了敲除片段长度与敲除效率的关系(根据等位基因分析)，得出敲除效率与敲除长度呈负相关(图4)。可以看出，当敲除片段在23kb以内时，敲除效率基本都在10%以上，甚至很多片段的敲除效率都在20%以上甚至30%以上。

除了淘汰效率的信息，文章中还有一些值得注意的细节。首先，6/40(15%)双等位基因敲除细胞被精确删除。27/87(31%)的单等位基因剔除细胞被精确剔除。另外，目前认为野生型spCas9的切割位点位于靶的17位和18位中间，切割产生平端。所谓精确敲除，是指SPCAS9的两个切割序列直接相连，中间没有任何其他序列的缺失或插入。其次，对于没有精确删除的细胞，由于是用NHEJ修复法修复两个平端，所以往往会引入一些indel，这些indel的长度大多集中在-10bp-0bp(负号代表删除，加号代表插入)。第三，对于双等位基因敲除细胞，其中一些在之一代中被测序。发现22/31(71%)细胞中两个等位基因之间的indel序列相同，9/31(29%)细胞中两个等位基因的indel片段不同。

如果你把这里的之一点和第三点结合起来，你会发现NHEJ的一些有趣的内容。比如如此高比例的精准修复，说明在NHEJ修复的过程中，不引入indel的可能性很大。例如，高百分比的纯合缺失(相同的indel)表明NHEJ可以根据模板进行修复。

注:低阳性率细胞筛选方法的优化

对于1MB(1000kb)以上的片段缺失，即染色体水平的基因组大片段缺失，本文筛选的比例为4/339，略多于1%。还有其他文章筛选后基本都是1%。如果我们要筛选单克隆细胞系，这么低的比例是一项非常大的工作。而且，1%并不意味着可以从100个细胞中筛选出一个细胞。被各种游戏厂商骗过抽卡的同学，可能更能理解什么是非酋长。所以，这里给你介绍一个方法，可以在有限稀释时，每孔稀释5-10个细胞，流式细胞仪每孔接种5-10个细胞。我们在这些孔中检测到阳性细胞后，就可以用这个孔中的细胞来选择一次单克隆，第二次单克隆的阳性率会直接上升到10%-20%。两种情况下，我们推荐上述方法:一是敲除片段大于1000kb其次，敲除片段在1000kb以下，PCR验证为阳性细胞，但经多次单克隆选择仍未筛选出阳性克隆。

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