质粒转化成功的鉴定:选择培养基通常用于筛选大肠杆菌|当前资讯

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关于质粒转化（质粒转化操作） 这个很多人还不知道，今天小编来为大家解答以上的问题，现在让我们一起来看看吧！

今天给大家分享一下质粒转化(质粒转化操作)的问题。以下是小编对这个问题的总结。让我们看一看。

一、如何鉴别质粒转化成功？

质粒转化成功的鉴定:选择培养基通常用于筛选大肠杆菌。

例如，如果重组质粒具有四环素抗性基因，那么通过使用含有四环素的选择性培养基将待测大肠杆菌接种到选择性培养基中。只有成功转入重组质粒的大肠杆菌才能在选择性培养基中生长，待测大肠杆菌也可以接种到另一种抗生素培养基中。但是成功转化的时间不长，这也是一种强化的反向验证。

染色体

转化过程包括吸附、吸收和整合具有转化能力的染色体DNA片段三个阶段。外源DNA首先被吸附在细菌细胞表面的一些接受位点上。肺炎球菌和枯草杆菌的接受位点没有特异性。它们可以吸附同种的DNA，也可以吸附大肠杆菌的DNA。流感嗜血杆菌的接收部位只能吸取附近细菌的DNA。

二。质粒转化大肠杆菌时，是用什么原理来表达目的基因

当质粒转化进大肠杆菌时，通过DNA复制原理表达目的基因。CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106~2×107 个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。）

三。成功质粒转化的意义

质粒转化是指将外源质粒导入原核细胞的过程。质粒转化是指将外源质粒导入原核细胞的过程。其中的转化是指将外源的脱氧核糖核酸分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。将质粒脱氧核糖核酸导入细菌的过程称为转化。此感受态细菌细胞在氯化钙低渗溶液中膨胀为球状。质粒脱氧核糖核酸与氯化钙形成抗磷酸钙复合物黏附于细菌表面，经42摄氏度短时间的热冲击处理，促进细胞吸收脱氧核糖核酸复合物。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，外源基因得到表达。在选择性培养平板上，可选出所需的转化子。

四。质粒转化步骤

质粒的转化，满满干货
原理：在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后，受体细胞的膜通透性发生改变，质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子，进入到细菌体内而实现扩增。

感受态细胞：是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。在基因工程中，用于转化的受体菌（Restriction-Modification 缺陷变异株，以防止对导入外源DNA进行切割）一般通过诱导的方式实现。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

质粒的转化主要包含

Ⅰ感受态细胞制备

Ⅱ质粒DNA转化

Ⅲ质粒DNA的提取

（Ⅰ）感受态细胞制备

1）从新活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

2）将该菌悬液按照1:100转接到液体培养基中，100ml，37℃振荡扩大培养，2~3h。当培养液开始浑浊时，间段性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。

3）培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20min，0℃-4℃离心10min（4000r/min）。

4）弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。

5）加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30min。（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率）

6）4℃离心10min（4000r/min）。

7）弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。

8）可直接用于实验，4℃保存。也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。

（Ⅱ）质粒DNA的转化

1）取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒1ul DNA混匀,同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。

冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最后一点冰融化后，迅即加入DNA. 解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。

2）冰浴30min，离心管放到42℃保温90s（不要摇动离心管）。冰浴时间短于30min ,可能影响转化率。然后迅速冰浴2min。

3）向离心管加800ulLB液体培养基，37℃振荡培养1h（150r/min）。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有更佳效果。

4）取适当（50ul）的复苏细胞培养液，涂布在含抗性的选择性培养基上，将培养皿放置在37℃恒温培养箱中，正置30min。等菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中，培养12~16h，出现菌落。

5）菌落结果：

① 无菌落

失败或者培养条件不充分

② 布满菌落,

呈苔样，失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致

③ 布满菌落

浓度太高，失败

④ 出现菌落

符合要求

Ⅲ）质粒DNA的提取

质粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒，实验操作简单，只需按照产品操作说明操作即可。不过对于其中主要试剂和作用的理解，能够避免实验过程中的一些问题，或者能够更好的解决问题。

各厂家提供的试剂盒中试剂不尽相同，一般的提取纯化试剂盒，主要包括以下试剂：

A. 细胞悬浮试剂: 主要作用是将菌体细胞悬浮起来。菌体悬浮不完全会导致裂解不完全，质粒的提取纯度和得率都会下降。通常需要在里面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常选用Tris-HCl作为体系中pH稳定缓冲液。EDTA，金属离子螯合剂可以和细菌体内的金属离子结合而DNase的活性受到抑制。有的会有葡萄糖，可用来增加溶液粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体沉淀时间。

B. 细胞裂解试剂：主要作用是裂解细胞，通过碱溶液的作用破坏细胞膜结构，使其双层膜结构改变，而导致细胞裂解。一般由一定浓度的NaOH和SDS组成。SDS的作用与后期中和过程中清除掉蛋白质等细胞杂质有关系。此步骤中需要注意的是，碱溶液的作用时间不能太长，也不可剧烈离心管，反之会导致碱破坏基因组DNA，导致同等大小的基因组DNA被提纯，造成污染。

C. 中和试剂：主要作用使中和掉细胞裂解试剂中的碱性物质，并去除掉其中的蛋白等杂质物质。组份有醋酸钾和醋酸，或者乙酸钾和冰乙酸。

D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多余的盐离子。DNA被试剂盒中的提取柱吸附之后，需要用wash buffer 洗脱掉多余的盐离子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇对后续酶切和测序反应会有影响，因此在后续洗脱DNA前，必须完全清除柱子中的乙醇。

E. 洗脱Buffer: 主要作用就是洗脱硅胶柱上的DNA样品。

1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通过重力的作用，使平衡buffer都流出。

2.细胞收获：对于高拷贝质粒（培养液中，>2µg DNA/mL)，吸取1-3ml培养液,离心去上清；对于低拷贝质粒（培养液中，\